實驗室內光學顯微鏡對觀察標本的要求

實驗室內光學顯微鏡對觀察標本的要求
　　用于顯微鏡觀察的標本必經經過一定的准備過程才能在顯微鏡生物顯微鏡下形成清晰的像，在入射照明和透射照明中，對于標本的光學要求有很大區別，在入射照明中像是由標本的反射光所形成的；相反，在透射照明中像是由透射光所形成的，在這種情況下反射光對于像的形成不僅無益，而且會降低像的清晰度。
　　
　　用入立體顯微鏡射光觀察的標本，它的准備工作十分簡單，只是清潔標本的表面並切割爲適當大小的小塊。而用透射光觀察的標本，必須具有由于光吸收的差異而産生的一定反差，才能在顯微鏡下被觀察到。爲此，標本必須經過一系列複雜的處理和制備過程，這種制備技術就是我們一般所說的生物顯微技術。
　　
　　從光學觀點出發，對于用透射光觀察的顯徽鏡標本有如下要求:
　　
　　(1)適當的厚度。這種厚度在較好的光學系統中能夠達到盡可能高的分辨力，並且與這個系統的場深相適應。
　　
　　(2)足夠的透明度。
　　
　　(3)能夠形成建立在吸收差異上的足夠的反差。
　　
　　實際上所有的生物學材料通過石蠟包埋、切片(或塗片)、貼附、溶蠟、透明等過程，能夠得到在厚度和透明度上符各要求的標本，然後通過染色程序得到一定程度的反差。
　　
　　通常在透射式光學顯微鏡中所使用的生物學和醫學組織切片，它的厚度一般爲3-7um。在這個厚度範圍內，當使用低倍物鏡(例如10x)觀察時，場深對于觀察整個切片厚度是完全足夠的；當使用高倍物鏡(例如100x)觀察時，場深僅僅是這個切片厚度的很小部分，不斷地從上到下移動細調可以得到切片的總體印象。因此，5^-7um厚的常規切片可以被認爲是在低放大倍數和高放大倍數理想情況之間的調和，兩者都較好地考慮到了場深和分辨力。同時由于種種原因，這種調和的厚度也滿足了實際工作中的許多要求，首先物體的細微結構不總是第一重要的；其次在很薄(1-v25m)的切片中生物標本中的立體關系就看不到了；與此相反，當使用8一10um或者更厚的切片時，除了分辨力上可覺察的損失而外，還會引起生物標本中不同層次的互相重益。
　　
　　經過固定、包埋、切片、溶蠟、透明等處理之後的動植物材料標本是足夠薄和透明
　　
　　的了，但是反差很小，並且這種反差主要來自于折射和衍射。顯然，這種標本在反差上是遠不理想的。但是這可以通過降低折射效果給它覆蓋上“吸收物質”，並通過吸收的差異而增大反差。在標本與周圍區域之間的折射，可以通過把標本封藏在加拿大樹膠或其他人工合成的封藏介質中的方法而減小。所有這些封藏介質經過揮發或聚合使其變硬之後，它們的折射率就接近被固定或被脫水的動植物組織主要成分的折射率。在大多數動植物組織中這個數值爲1。51-1。54。同時用這個方法還可以消除蓋玻片下面的反射引起的閃光。
　　
　　已經應用了一個多金相顯微鏡世紀，並且能夠給顯微鏡標本帶來較好反差的最有效方法是染色。一般沒有染色的生物標本，特別是當放置在具有與生物標本相近折射率的介質中時，像的反差是很小的。在染色的標本中，像的反差的增大是建立在染料選擇性分布的基礎上。染色與未染色標本在反差上有巨大差異。
　　
　　生物切片經常粘貼在具有26x76mm標准尺寸和1。1^-1。3mm厚度的載玻片上，載玻片的兩面應是平行平面。對于載玻件厚度的要求不是很嚴格的，但是當它的厚度超過一些較高矯正程度集光器的自由工作距離時，載玻片厚度對于聚焦光源以及在物體平面上形成視場光闌的像就變得重要了。對于這種情況，厚度爲0。9^-1。0mm的載玻片是比較合適的。